单个细菌细胞的基因组进行测序技术上一直困难由于看似无可救药的偏见在的基因扩增阶段过程中,很难产生高覆盖率从正是一个细菌细胞基因组序列。

由单细胞研究人员开发的一种新工艺中心、青岛生物能源和生物处理技术研究所(QIBEBT)中国科学院(CAS),然而,大大减少了偏见,单细胞研究的开放全新的景观。

该研究发表在在生物工程和生物技术前沿6月29日。

它是正常的在使用传统的基因测序方法同时使用数以百万计的细胞。但这种测序散装细胞不可避免地抹平了细胞之间的差异,使得它难以探索的关系在不同的细胞谱系或执行任何其他类型的研究,取决于考虑单个细胞。对细菌这样的技术挑战尤其严重,因为细菌细胞是如此之小,其DNA含量几个数量级低于人类或动物细胞。

为了完成测序的基因或基因组,DNA首先必须“放大”。基因扩增,有时被称为“分子复印”,使数百万甚至数十亿的DNA片段的拷贝。

放大给大部分基因测序带来一些问题。然而,

在细菌单细胞DNA扩增,尤其是整个基因组,可供复制的DNA数量非常有限,和放大过程可以引入偏见,代表了不同地区或低估的基因组。

“减少放大偏见的圣杯了单细胞基因组扩增研究人员,”张说,一个生物QIBEBT和论文的主要作者。“我们认为我们已经找到了一种方法来解决这个问题。”

研究人员开发了一个过程被称为提高单细胞基因组扩增(iSGA)。它主要包括蛋白质工程和过程工程的放大能力phi29 DNA聚合酶。phi29 DNA聚合酶是常用于单细胞全基因组扩增,但患有基因组覆盖率和低效率低的问题。

我们开发的“iSGA phi29 DNA聚合酶是两倍多比传统phi29 DNA聚合酶高效和健壮的,”张贾说。”这也是近11倍比的主要常见的商业版本便宜。”

研究人员通过工程实现聚合酶提高放大能力。使用一个名为区划的方法自我复制(CSR)进化phi29 DNA聚合酶,他们修改其结构来提高其活性,特异性和稳定性。“新开发的DNA聚合酶,我们称为HotJa Phi29 DNA聚合酶,显示了更好的基因组覆盖率(99.75%)在更高的温度下(40℃)与现有的商用聚合酶相比,”一位资深作者说徐教授剑从单细胞QIBEBT中心。

他们也放大缓冲放大反应条件的优化和修改(解决方案,提供了一个合适的化学环境DNA聚合酶)提高稳定性和phi29 DNA聚合酶的活动。此外,研究人员开发了一个更有效的去污方法在放大过程中减少污染。

研究者们现在打算优化iSGA方法和HotJa Phi29 DNA聚合酶在各种应用程序和样品类型,并进一步降低成本。这个团队开发了一系列的工具包括RACS-Seq FlowRACS和EasySort微生物单细胞的功能分类。他们的目标,通过开发这些仪器和试剂,是使微生物学家和顺序进行排序任何单个微生物细胞在地球上,而不用担心数据质量或试剂成本。

改进的单细胞基因组扩增的高效HotJa Phi29 DNA聚合酶(我法师刘洋)

(文本由张贾)

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